土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

实验目的

学会分离土壤中分解尿素的细菌，并掌握稀释涂布平板法计数。

实验原理

尿素分解菌合成脲酶，将尿素分解为氨：CO(NH2)2 + H2O → 2NH3 + CO2（脲酶）。以尿素为唯一氮源的培养基只允许能利用尿素的细菌生长。培养基中加入酚红指示剂，氨使 pH 升高，指示剂变红，可进一步鉴定。

实验器材

• 土壤样品
• 以尿素为唯一氮源的选择培养基
• 牛肉膏蛋白胨培养基（对照）
• 无菌水
• 培养皿、涂布器、移液管
• 酚红指示剂
• 恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅

实验步骤

1. 配制选择培养基并灭菌，倒平板。
2. 取土壤样品，用无菌水逐级稀释成不同倍数的稀释液。
3. 取适量稀释液涂布到平板上，每个稀释度设置多个重复。
4. 将平板倒置于恒温培养箱中培养，同时设置对照平板。
5. 选择菌落数在 30～300 的平板，统计菌落数并取平均值。
6. 在培养基中加入酚红指示剂，观察菌落周围是否变红。

实验现象与结论

选择培养基上只长出少量菌落，对照平板上的菌落更多、种类更杂。加入酚红的培养基上，尿素分解菌菌落周围出现红色，说明有氨产生。统计菌落数后可估算每克土壤样品中的活菌数。

注意事项

• 全程无菌操作，涂布器用酒精灯灭菌，注意防火。
• 培养后的平板要经高压灭菌后再处理。
• 实验后用肥皂洗手。

常见问题

为什么统计菌落数要选 30～300 的平板？

菌落数太少误差大，太多则容易连成一片，30～300 的结果较为可靠。

稀释涂布平板法的计数结果为什么常偏低？

当两个或多个细胞靠在一起时，只会形成一个菌落，因此统计值往往比实际活菌数低。