稀释涂布平板法

实验目的

掌握梯度稀释和涂布操作，学会用菌落数估算样品中的活菌数。

实验原理

将菌液进行一系列梯度稀释，再涂布到固体培养基上，稀释度足够高时，培养基上的一个活菌繁殖成一个菌落。选取菌落数在 30～300 的平板计数，可按公式估算：每克（毫升）样品中的菌数 =（C÷V）×M，其中 C 为平均菌落数，V 为涂布体积，M 为稀释倍数。

实验器材

• 待测样品（如土壤浸出液）
• 无菌水（9 mL 试管若干）
• 移液器或无菌吸管
• 固体培养基平板
• 涂布器
• 酒精灯、酒精
• 恒温培养箱

实验步骤

1. 取样品加入无菌水中，充分振荡，制成菌悬液。
2. 取 1 mL 菌悬液加入 9 mL 无菌水，依次做 10 倍梯度稀释。
3. 取不同稀释度的菌液各 0.1 mL，滴加到平板中央。
4. 涂布器在酒精中浸泡后灼烧、冷却，将菌液均匀涂布。
5. 待菌液被吸收后，将平板倒置放入恒温箱中培养。
6. 选取菌落数在 30～300 的平板计数并计算。

实验现象与结论

稀释度较低的平板菌落过多、连成一片，稀释度过高的平板菌落很少，只有适当稀释度的平板才能得到分散的单菌落。由于两个或多个细胞相连可能形成一个菌落，统计的菌落数往往比实际活菌数偏低。

注意事项

• 涂布器蘸酒精后灼烧，注意远离酒精瓶。
• 涂布器灼烧后需冷却，以免烫死菌体。
• 用过的平板和吸管按规定灭菌处理。

常见问题

为什么计数时选择菌落数在 30～300 的平板？

菌落过少误差大，过多则菌落易重叠，30～300 的平板结果相对更可靠。

稀释涂布平板法的计数结果为什么偏低？

当两个或多个细胞连在一起时，培养后只形成一个菌落，所以统计值往往低于实际活菌数。